Tiefes Lernen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12575 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Optische Pinzetten üben eine starke Einfangkraft auf Zellen aus, weshalb es von entscheidender Bedeutung ist, die Bewegung gefangener Zellen zu analysieren. Die Rotation von Zellen spielt eine wichtige Rolle bei ihren Schwimmmustern, beispielsweise bei Spermien. Wir haben eine schnelle Deep-Learning-basierte Methode vorgeschlagen, mit der die Projektionsausrichtung ellipsoidähnlicher Zellen ohne zusätzliches optisches Design automatisch bestimmt werden kann. Diese Methode wurde zur Analyse der planaren Rotation gefangener Spermien mithilfe einer optischen Pinzette verwendet und demonstrierte ihre Machbarkeit bei der Extraktion der Rotation des Zellkopfes. Darüber hinaus verwendeten wir diese Methode, um die Aktivität von Spermienzellen zu untersuchen, indem wir Variationen in der Rotationsrate der Spermien unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich Temperatur und Laserleistung, untersuchten. Unsere Ergebnisse belegen die Wirksamkeit dieser Methode und die entwickelte Rotationsanalysemethode könnte klinisches Potenzial für die Bewertung der Spermienqualität haben.

Optische Pinzetten (OT) wurden umfassend zum Einfangen und Manipulieren von Mikropartikeln und Mikroorganismen wie Polystyrolkügelchen, Hefezellen, Spermien und Escherichia coli erforscht1,2,3,4. Während des Fortpflanzungsprozesses müssen die Spermien über den weiblichen Fortpflanzungstrakt zur Eizelle gelangen. Dabei werden Spermien mit geringer Beweglichkeit durch Barrieren wie den Zervixschleim5 abgeschirmt. Es wurden umfangreiche Untersuchungen zur Dynamik von in optischen Pinzetten gefangenen Spermien durchgeführt, darunter Studien, die verschiedene Aspekte wie Chiralität und Motilitätskraft untersuchten6,7. Diese Forschungsrichtung hat potenziellen Wert für die Qualitätsprüfung einzelner Spermien, die für assistierte Reproduktionstechnologien wie die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) von entscheidender Bedeutung ist8. Derzeit besteht die Hauptmethode zur schnellen Verfolgung der Bewegung des Kopfes einer Samenzelle in der Verfolgung ihres Schwerpunkts, wobei zur Segmentierung herkömmliche Clustering-Algorithmen verwendet werden9,10. Dann haben Nascimento et al. nutzten diese Methode, um die krummlinige Geschwindigkeit (VCL) des Kopfes zu berechnen und so die Spermienaktivität zu charakterisieren11. Allerdings erzielen herkömmliche Segmentierungsmethoden im Sichtfeld von Objektivlinsen mit hoher numerischer Apertur aufgrund des komplexen Hintergrundrauschens schlechte Segmentierungsergebnisse. Darüber hinaus sollte für komplexere Bewegungsmuster von Spermien, wie z. B. Rotation, ein zusätzlicher optischer Aufbau konzipiert werden, und entsprechende Algorithmen zur Bestimmung der dreidimensionalen Bewegung der Spermien arbeiten in der Regel relativ langsam12.

Deep Learning wird im Bereich der Segmentierung von medizinischen Zellbildern häufig eingesetzt, insbesondere für die Zählung bestimmter Zellen13, die Segmentierung von Leber und Lebertumoren14, die Segmentierung von Gehirn und Hirntumoren15 usw. Und im Vergleich zu herkömmlichen Methoden weist es eine überlegene Segmentierungsleistung und Robustheit auf16. 17.Dieses Werkzeug kann auch mit einer optischen Pinzette kombiniert und zur axialen Lokalisierung von Mikrokügelchen18, zur Vorhersage der optischen Kraft der optischen Pinzette19 und zur Messung der Fallensteifigkeit20 eingesetzt werden. In dieser Studie schlagen wir eine hocheffiziente Methode vor, die die Ausrichtung des Spermienkopfes mithilfe einer auf Deep Learning basierenden Segmentierung extrahiert. Wir kombinieren es mit einer optischen Pinzette, um Spermien dynamisch einzufangen und die Rotationsmotilität einzelner Spermien direkt und gleichzeitig zu analysieren. Diese Methode eignet sich auch für andere ellipsoidartige Zellen oder Bakterien wie Escherichia coli. Unsere Experimente analysierten den Unterschied in der Rotationswinkelgeschwindigkeit von Spermien bei unterschiedlicher Laserausgangsleistung und bestätigten, dass unsere Methode potenzielle Anwendungen in der klinischen Forschung zur Quantifizierung der Spermienmotilität und zur Erkennung der Motilität einzelner Spermien hat.

Um die Projektionsphaseninformationen des Spermas zu erhalten, verwendeten wir ein selbst entwickeltes optisches Pinzettensystem, wie in Abb. 1a dargestellt. In unserem Versuchsaufbau verwendeten wir einen Dauerstrichlaser (Coherent Verdi G, 2 W), um einen 532-nm-Laserstrahl zu erzeugen. Dieser Laserstrahl wurde zur Strahlaufweitung in ein Strahlformungssystem (BSS) geleitet. Der resultierende linear polarisierte Laserstrahl wurde dann auf einen dichroitischen Spiegel gerichtet, der ihn auf die hintere Apertur eines Ölimmersionsmikroskopobjektivs (Nikon, 100\(\times\) Ölimmersion; NA = 1,4; WD = 0,13 mm) reflektierte. Der Strahl wird durch einen reflektierenden und reinen Phasen-Flüssigkristall-Raumlichtmodulator (Holoeye, HED6010-L-VIS) im Formungssystem moduliert. Die interessierende Probenlösung wurde auf einen Probenpool geladen und in der hinteren Brennebene des Ölspiegels positioniert, der mithilfe eines spannungsgesteuerten Tisches (Thorlabs; ZFM2030) gesteuert wurde. Die Beleuchtung der Probenkammer erfolgte durch eine LED-Lichtquelle und die Abbildung der Probe erfolgte mit einer CMOS-Kamera (Sentech; STC-mbs241U3V; 163 fps).

Bei der Versuchsapparatur (a) und dem schematischen Diagramm der Phasenwinkelextraktion (b) stellt der weiße Maßstabsbalken 10 \(\upmu\)m dar.

Vor dem Experiment haben wir die Position der optischen Falle kalibriert und einen 150 \(\times\) 150 Pixel großen Bereich um das Fallenzentrum als interessierende Region (ROI) verwendet, um Störungen durch andere schwimmende Spermien auszuschließen, wie in Abb . 1b. Für den extrahierten Bildbereich haben wir die Bildsegmentierung verwendet, um eine Konturerkennung durchzuführen und die Projektionsphase der Kopfform zu erhalten. Anschließend wurde die Drehwinkelgeschwindigkeit aus der Phasendifferenz zwischen aufeinanderfolgenden Bildern berechnet.

Um schnellere und genauere Segmentierungsergebnisse zu erzielen, haben wir einen Deep-Learning-Segmentierungsalgorithmus eingeführt. Dies liegt daran, dass die herkömmliche Grauschwellensegmentierung, wie z. B. die Level-Set- und Clustering-Methode, stark durch Rauschen bei der Segmentierung von Zellbildern mit hoher Vergrößerung unter Bildgebung mit hoher NA-Linse beeinflusst wird, wie in Abb. 2b dargestellt. Darüber hinaus basieren diese Methoden auf manueller oder adaptiver Anpassung von Parametern, was in komplexen Szenen möglicherweise nicht effektiv ist. Auf Deep Learning basierende Bildsegmentierungsalgorithmen sind in den letzten Jahren zu einem heißen Thema geworden. In dieser Studie haben wir das U-Net++-Netzwerk zur Bildsegmentierung verwendet. U-Net++ ist ein überwachtes Lernnetzwerk, das auf dem vollständig faltenden neuronalen Netzwerk U-Net basiert. Durch die Neugestaltung der Skip-Verbindungen aggregiert es Informationsmerkmale verschiedener semantischer Skalen im Decoder-Subnetzwerk und bildet so eine hochflexible Feature-Fusion-Lösung und hat bei vielen biologischen Datensätzen und Backbone-Architekturen gute Ergebnisse erzielt21. Als eine Art überwachtes Lernen erfordert das Training dieses Modells eine bestimmte Datenmenge, um bessere Segmentierungsergebnisse zu erzielen. Abbildung 2a zeigt das schematische Diagramm unserer Lösung. Die von uns verwendete Verlustfunktion ist der Hybridverlust, der den Kreuzentropieverlust und den Soft-Dice-Koeffizientenverlust kombiniert. Der Hybridverlust ist definiert als22

wobei \({{y}_{n,c}}\in \text {Y}\) und \({{p}_{n,c}}\in \text {P}\) die Zielbezeichnungen bezeichnen und vorhergesagte Wahrscheinlichkeiten für Klasse c (hier nur zwei Klassen) und das n-te Pixel im Trainingsstapel. Unser Trainingsdatensatz bestand aus 125 Bildern gefangener Spermien mit einer Größe von 120 \(\times\) 120 Pixeln und den entsprechenden manuell segmentierten Ergebnissen. Die Netzwerktiefe wurde auf 4 Schichten festgelegt und die optimalen Netzwerkparameter wurden mithilfe einer Kreuzvalidierung berechnet. Nach der Verarbeitung der segmentierten Spermienbilder kann eine Schwellenwertmethode zur Binarisierung verwendet werden, um die Maske zu extrahieren. Trotz der geringen Größe des Trainingsdatensatzes sind die Segmentierungsergebnisse bemerkenswert, insbesondere im Vergleich zu den beiden anderen Modellen, wie in Abb. 2b gezeigt, wo der Schnittpunkt über der Union (IoU) und die Dice-Koeffizienten etwa 90 % erreichen können. Die IoU- und Dice-Koeffizienten sind wie folgt definiert23, wobei S die segmentierte Maske und T die Wahrheitsmaske darstellt. Für jeden von ihnen bedeutet ein höherer Wert einen höheren Grad an Überlappung und Ähnlichkeit zwischen dem Segmentierungsergebnis und der Referenzmaske

Die Level-Set- und Clustering-Modelle in der Studie verwendeten Module von ImageJ 1.53v24. Dieser Ansatz kann durch den Einsatz auf Hochleistungs-GPUs eine schnelle und genaue Bildsegmentierung in Millisekunden erreichen und eine Echtzeitsegmentierung erreichen, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Experimente werden mit der NIVIDA GeForce RTX 2080 GPU mit 8 GB Speicher durchgeführt.

Diagramm des Modelltrainingsprozesses (a); Zeigt den für das Training verwendeten Trainingssatz, einschließlich des Originalbilds und des vorsegmentierten Bilds, sowie den Bildsegmentierungsprozess unten. Qualitativer Vergleich zwischen U-net++, Level-Set und Clustering-Methode (b); Zeigt das segmentierte Ergebnis und die endgültige Maskenausgabe für das eingeschlossene Sperma. Die entsprechenden quantitativen Bewertungen werden am Ende jeder Vorhersage bereitgestellt (IoU|Dice). Bilder eines bei 0 ms, 100 ms, 200 ms und 300 ms gefangenen Spermiums (c), wobei die Originalbilder oben, die segmentierten Bilder in der Mitte und die konturextrahierten Ergebnisse unten angezeigt werden. Die grüne Markierung stellt die Phase der angepassten Ellipse dar.

Die projizierte Ausrichtung des Spermas muss aus dem segmentierten Bild bestimmt werden. Der menschliche Spermienkopf ist flach und elliptisch, mit einer Länge von etwa 4–5 \(\upmu\)m und einer Breite von etwa 2,5–3,5 \(\upmu\)m25. Diese elliptische Form unterscheidet sich von der Kreisform typischer Zellen, sodass die zweidimensionale Ausrichtung der Spermien visuell bestimmt werden kann. In dieser Studie wird das von OpenCV26 bereitgestellte elliptische Anpassungstool verwendet, um die Form des Spermienkopfes in dem aus dem segmentierten Spermienbild erhaltenen Graustufenbild anzunähern und die Phaseninformationen \(\alpha\) des Kopfes zu erhalten, wie gezeigt in Abb. 1b. Abbildung 2c zeigt eine Reihe von Bildern segmentierter Spermien zu vier verschiedenen Zeitpunkten zusammen mit den Ergebnissen der Ellipsenanpassung. Es ist zu beobachten, dass die Phase genau extrahiert wird. Obwohl das segmentierte Ergebnis bei seitlicher Spermienlage oval erscheint, wird die Phase dennoch genau erfasst. Die absolute Winkelgeschwindigkeit wird dann mithilfe der Vorwärtsdifferenzmethode ermittelt, wie in der folgenden Gleichung dargestellt, wobei k das k-te Bild bedeutet und fps die Aufzeichnungsrate von 163 Bildern pro Sekunde bezeichnet:

Die oben genannte Methode wurde verwendet, um den Phasenwert eines rotierenden Spermiums unter optischer Einfangkontrolle anhand von Spermienproben eines einzelnen gesunden Mannes zu bestimmen. Das Experiment wurde bei einer Temperatur von 23 \(^{\circ }\)C durchgeführt. Die Laserausgangsleistung wurde auf 400 mW eingestellt. Die Lasereinfangleistung, die das Sperma erreicht, kann mit einem Leistungsmesser gemessen werden und beträgt etwa 120 mW, was zu einem Temperaturanstieg von etwa 1 \(^{\circ }\)C27,28,29 führt. Um das Risiko einer lichtinduzierten Schädigung der Spermien zu minimieren, wurde die Einfangdauer der gefangenen Spermien auf nicht mehr als 4 s30 begrenzt. Um eine vergleichende Analyse zu erleichtern, haben wir uns entschieden, drei repräsentative Spermien zur Bewertung auszuwählen, nämlich \(S_0\), \(S_1\) und \(S_2\). \(S_0\) schien unter mikroskopischer Beobachtung inaktiv mit minimaler oder keiner erkennbaren Bewegung zu sein, während sowohl \(S_1\) als auch \(S_2\) schnelle Oszillationsbewegungen des Kopfes in einem gefangenen Zustand zeigten, im Gegensatz zum totenähnlichen Zustand von \ (S_0\). Abbildung 3a–c, d–f veranschaulichen die Phaseninformationen und die berechnete Winkelgeschwindigkeit für die drei oben genannten Spermien. Es ist ersichtlich, dass für die grundsätzlich inaktive Spermienzelle das Signal in Abb. 3d eine niederfrequente Sparsität zeigt, während das Signal in Abb. 3e, f eine hochfrequente Dichte aufweist. Für das Winkelgeschwindigkeitssignal haben wir zur statistischen Analyse ein Boxplot verwendet. Die Ergebnisse sind in Abb. 3g dargestellt. Es ist ersichtlich, dass für \(S_0\) sowohl der Mittelwert als auch der Median tendenziell 0 sind, während für die anderen beiden gefangenen, aktiveren Spermien ihr Mittelwert und Median relativ größer sind. Darüber hinaus haben wir in der Statistik einen T-Test mit zwei Stichproben verwendet, um festzustellen, ob zwischen den beiden Gruppen ein signifikanter Unterschied in der mittleren Winkelgeschwindigkeit besteht. Und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Rotationsaktivitätsniveaus von \(S_2\)-Spermien wahrscheinlich höher waren als die von \(S_1\)-Spermien, was durch einen statistisch signifikanten p-Wert von weniger als 0,01 angezeigt wird. Dementsprechend könnten wir \(S_2\)-Spermien als Ziel unserer Forschung auswählen, da sie im Vergleich zu \(S_1\)-Spermien eine relativ höhere Beweglichkeit aufweisen.

Phasenwinkelsignal und entsprechende Winkelgeschwindigkeitsrate für unterschiedliche Motilitäten der Spermien \(S_0\) (a,c), \(S_1\) (b,e) und \(S_2\) (c,f), wenn sie gefangen sind im AT. Vergleich der Winkelgeschwindigkeitsrate für Spermien vor (grüne Daten) und nach (blaue Daten) ihrer Einklemmung. Dargestellt sind Mittelwerte mit 25–75 % der Daten. Das Signifikanzniveau wurde auf **p < 0,01 festgelegt.

Darüber hinaus haben wir mithilfe von ImageJ24 manuell die Flugbahn der nicht gefangenen Spermien (ca. 40 Bilder) verfolgt und die Methode der ROI-Verfolgung verwendet, um die Winkelgeschwindigkeit der schwimmenden Spermien vor der Erfassung anzugeben, wie in Abb. 3f dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Geschwindigkeitsverteilung des nicht eingefangenen Spermiensignals größer ist. Dies liegt daran, dass die Spermien während der Rotation dem Drehmoment der optischen Falle ausgesetzt sind, was zu einer Verringerung der Rotationsgeschwindigkeit führt, wie sich im größeren Bereich von 25–75 % der Schwimmgruppe im Vergleich zur gefangenen Gruppe zeigt. Allerdings ist die durchschnittliche Ausgangsleistung von eingeschlossenen und nicht eingeschlossenen Spermien grundsätzlich gleich.

Um die Machbarkeit der Methode weiter zu bestätigen. Wir teilten das Sperma aus derselben Probe in zwei Teile (jeweils etwa 800 \(\upmu\)L), einer wurde 6 Stunden lang bei 4 \(^{\circ }\)C gekühlt und der andere wurde bei Zimmertemperatur gelagert Temperatur(23 \(^{\circ }\)C) für 6 h zur statistischen Analyse der durchschnittlichen Winkelgeschwindigkeit bei einer Laserausgangsleistung von 400 mW. Um den durch die Wiedererwärmung verursachten Anstieg der Beweglichkeit der gekühlten Spermien so weit wie möglich zu vermeiden, haben wir die Probe und die eingefangenen Spermien nach 5 Entnahmen ausgetauscht. Die Ergebnisse sind in Abb. 4a dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die durchschnittliche Aktivität gekühlter Spermien um etwa 30 % reduziert ist, was mit der erwarteten Abnahme der Spermienaktivität nach der Kühlung übereinstimmt. In der Zwischenzeit haben wir 300 mW, 400 mW und 500 mW als Laserausgangsleistung gewählt, wobei andere Bedingungen konstant gehalten wurden, um die Winkelgeschwindigkeit der gefangenen Spermien bei unterschiedlichen Einfangenergiepotentialen zu ermitteln. Was den durch optisches Einfangen verursachten Temperaturanstieg betrifft, so bleibt der maximale Temperaturunterschied, der durch unterschiedliche Laserleistungen verursacht wird, aufgrund eines Unterschieds von 30 mW zwischen den tatsächlichen Lasereinfangleistungen innerhalb von 1 \(^{\circ }\)C27,28,29. Dieser Temperaturunterschied hat einen minimalen Einfluss auf das Experiment. Wie in Abb. 4b dargestellt, ist zu erkennen, dass bei diesen Leistungsstufen die Spermien stabil eingefangen werden können. Es ist offensichtlich, dass die gefangenen Spermien bei 400 mW die höchste durchschnittliche Winkelgeschwindigkeit und den größten Verbreitungsbereich aufweisen. Bei 500 mW und 300 mW sind ihre Geschwindigkeiten relativ niedrig und ihre Reichweiten schmal. Dies hat wahrscheinlich zwei Gründe: Das auf das erfasste Ziel ausgeübte Drehmoment weist eine positive Korrelation mit der Intensitätszunahme auf, die direkt mit der Laserausgangsleistung zusammenhängt31,32. Bei 500 mW ist das Widerstandsdrehmoment zu hoch, was zu einer übermäßigen Dämpfung der Spermien und einer Einschränkung ihrer Rotation führt; Bei 300 mW hingegen ist die Energie zu niedrig, um hochaktive Spermien einzufangen33, was zu einer geringeren Rotationsmotilität der eingefangenen Spermien führt. Daher ist 400 mW die ideale Ausgangsleistung mit dem größten Bereich der Rotationsmotilität der erfassten Spermien, und die ausgewählte Leistung in praktischen Anwendungen muss über der geeigneten Ausgangsleistung liegen, um maximale Unterscheidbarkeit zu erreichen.

Vergleich der Winkelgeschwindigkeit der Spermien bei verschiedenen Temperaturen (a), mit ungekühlten Spermien links und gekühlten Spermien rechts. Dargestellt sind Mittelwerte ± SD mit 25–75 % Daten (grüne Daten und blaue Punkte). Vergleich der Spermienwinkelgeschwindigkeit für unterschiedliche Laserausgangsleistungen (b). Dargestellt sind Mittelwerte ± SD mit 25–75 % Daten. In beiden steht n für die Gesamtzahl der Stichproben.

In dieser Forschungsarbeit wird eine auf Deep Learning basierende Methode zur Bildsegmentierung von Spermienköpfen vorgeschlagen, die die dynamische Extraktion der Rotationswinkelgeschwindigkeit als Kriterium für die optisch erfasste Spermienmotilitätserkennung ermöglicht. Die Studie demonstriert die Zuverlässigkeit der Methode durch den Vergleich gekühlter und normaler Spermienproben und ermittelt den optimalen Laserleistungsbereich zur Maximierung der Unterscheidung zwischen Spermien. Diese Forschung bietet eine solide Grundlage für die anschließende Spermienauswahl mithilfe optischer Pinzetten und hat das Potenzial für klinische Anwendungen wie ICSI, die die Ergebnisse für Paare mit Fruchtbarkeitsproblemen verbessern könnten (Ergänzende Informationen).

Die menschlichen Samenproben wurden von einzelnen Patienten im Reproductive Medicine Center, dem ersten angegliederten Krankenhaus der Anhui Medical University, entnommen. Alle Patienten gaben vor der Aufnahme in die Studie ihre Einverständniserklärung ab. Die Samenproben wurden in Befruchtungsmedium (Cook Medical, USA) verdünnt und für nachfolgende Experimente bei 4 °C gelagert. Vor dem Laden in den Probenpool des selbstgebauten optischen Pinzetteninstruments wurden die Spermienproben mit Befruchtungsmedium weiter um das 20- bis 40-fache verdünnt.

Alle Analysen wurden mit Origin 2021b durchgeführt. Ein zweiseitiger P-Wert von \(<0,05\) wurde als signifikant angesehen.

Die Studien mit menschlichen Teilnehmern wurden von der Biomedizinischen Ethikkommission der Anhui Medical University überprüft und genehmigt. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie ab. Alle Methoden wurden gemäß den universitären Richtlinien und Vorschriften für Spermienexperimente durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken der National Natural Science Foundation of China (Grants 12232017, 11627803, 32061160475 und 12222212) für die finanzielle Unterstützung und dem First Affiliate Hospital der Anhui Medical University für die Bereitstellung der Proben.

CAS Key Laboratory of Mechanical Behavior and Design of Materials, Abteilung für moderne Mechanik, Universität für Wissenschaft und Technologie von China, Hefei, 230027, China

Jiangcheng Zhao, Chuanbiao Bai und Qingchuan Zhang

School of Biomedical Engineering, Anhui Provincial Institute of Translational Medicine, Anhui Medical University, Hefei, 230027, China

Zhiguo Zhang

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JZ konzipierte und führte die Experimente unter der Leitung von QZ mit Unterstützung von CB und ZZ durch. Das Manuskript wurde von JZ in Absprache mit allen anderen Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Qingchuan Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhao, J., Bai, C., Zhang, Z. et al. Auf Deep Learning basierende Methode zur Analyse der optisch eingefangenen Spermienrotation. Sci Rep 13, 12575 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39819-7

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Eingegangen: 18. Mai 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39819-7

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